豬輪狀病毒PCR檢測試劑盒說明書

【產品名稱】

  通用名稱：豬輪狀病毒PCR檢測試劑盒（實時熒光PCR法）

  英文名稱：Porcine Rotavirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】25T/盒 & 50T/盒

【預期用途】

本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測豬輪狀病毒，對豬輪狀病毒引起的胃腸炎及其并發(fā)癥的診斷及療效評估有重要指導意義。

【檢驗原理】

本試劑盒針對豬輪狀病毒組高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含豬輪狀病毒組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為豬基因組DNA，陽性對照為失去活性的PRV cDNA。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1.采集時間：采集患兒發(fā)病3日內或入院24小時，且未服藥之前的糞便標本。

2.采集方法

⑴ 自然排便采集法：自然排便后，收集糞便標本每份5～10g左右；應放置在無菌容器中，貼上帶有wei一識別碼的標簽；

⑵ 直腸拭子法：對難以獲得糞便或排便困難的患者及嬰幼兒，可采用直腸拭子法采集標本，標本采集完后插入無菌試管待檢；

3.應避免標本間交叉污染；

4.標本采集完畢后若不能立即檢測，可放置于-20℃的冰箱中保存，避免標本反復凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數

 (3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。

4.PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。

2.標本結果判定：

（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期。

（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結果。

2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產生假陰性結果。

3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結果。

【產品性能指標】 產品的最di檢出限為10² Copies/mL，產品CV值≤5%。

【注意事項】

1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。

2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理。

3. 每次實驗應該設置陰、陽性對照。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心。

5. 試劑盒內所配陰性和陽性對照在di一次使用前應全部轉移至標本準備區(qū)，并單獨存放。

6. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記。

7. 儀器擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。

9. 實驗過程中產品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。